سنجش ترکیبات ارگانوفسفره در نمونه های سرم انسانی از طریق طراحی بیوسنسور ارگانوفسفر هیدرولاز-کوئنچر

ترکیبات ارگانوفسفره متعلق به دسته ای از نوروتوکسین های بسیار سمی هستند که معمولا به عنوان حشره کش، جونده کش و ترکیبات شیمیایی جنگی مورد استفاده قرار می گیرند. یکی از مهم ترین موارد کاهش خطرات ترکیبات ارگانوفسفره برای انسان و محیط، مانیتورینگ این ترکیبات در آب، خاک و مایعات بیولوژیک می باشد. تا کنون بیوسنسورهای مختلفی برای شناسایی ترکیبات ارگانوفسفره ایجاد شده اند، که در این میان حسگرهای زیستی بر پایه آنزیم ارگانوفسفرهیدرولاز (oph) از اهمیت فوق العاده ای برخوردار می باشد. آنزیم ارگانوفسفرهیدرولاز قادر به هیدرولیز طیف وسیعی از ترکیبات ارگانوفسفره می باشد. در این مطالعه آنزیم هم به صورت نوترکیب در مخمر پیکیا پاستوریس تولید شد و هم از باکتری هایی که از خاک های تیمار شده با ترکیبات ارگانوفسفره بدست آمده بودند، جداسازی گردید. آنزیم نوترکیب پایداری دمایی و ph بالایی از خود نشان می داد و به لحاظ km (96/45) پایین تر از موارد نوترکیب مشابه بود. گونه باکتریایی جدا شده به لحاظ مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی و در سطح مولکولی به دنبال تعیین توالی 16s rrna به عنوان سودوموناس آئروژینوزا nl01 شناسایی و تایید شده و در genbank تحت شماره سریال jf331665 قرار گرفت. در این تحقیق از تکنیک fret بر اساس میانکنش بین فلوروفور کومارین1 (آنالوگ ساختاری کومارین و مهارکننده رقابتی آنزیم oph) و مولکول های دابسیل (خاموشگر) برای تشخیص آنزیمی ترکیبات ارگانوفسفره استفاده گردید. خاموشگرها (quenchers) به طور کووالان به آنزیم نوترکیب متصل شدند و قادر به خاموش سازی نشر حاصل از مهارکننده فلورسانسی آنزیم، کومارین1 ، در طول موج مشخص بودند. در غیاب سوبسترای ارگانوفسفره مهارکننده فلورسانسی به آنزیم متصل شده و توسط خاموشگر های متصل به آنزیم خاموش گردید. افزایش شدت فلورسانسی نمونه، زمانیکه سوبسترای پارااکسون اضافه شد، نشان دهنده جابجایی کومارین1 به وسیله سوبسترای پارااکسون بود. با افزایش پارااکسون، شدت فلورسانسی نمونه افزایش یافت. منحنی کالیبراسیون (بر اساس شدت فلورسانس نسبی،rfi) برای پارااکسون نشان داد که حداقل غلظت پارااکسون تشخیص داده شده در حدود 12 میکرومولار می باشد که کمتر از km آنزیم برای این سوبسترا بود. حالت خطی مناسبی در منحنی کالیبراسیون تا غلظت 200 میکرومولار مشاهده گردید. در نمونه های سرم spike شده با غلظت های مشخص پارااکسون نیز نتایج مشابهی مشاهده گردید. به طوریکه حدود 80% پارااکسون موجود در سرم توسط کونژوگه آنزیم-دابسیل مورد شناسایی قرار گرفت. علت این امر شاید اتصال سم ارگانوفسفره به برخی پروتئین های خونی نظیر آلبومین و خارج شدن از دسترس آنزیم ارگانوفسفرهیدرولاز موجود در بیوکونژوگه باشد.